细胞冻存是一种用于在低温条件下保存细胞的技术，旨在长时间维持细胞的活性和功能。这个过程对细胞系的长期存储、实验的重复性、基因库的建设以及细胞治疗的储备具有重要意义。通过冻存，细胞在传代过程中可以减少遗传变异，避免因污染、环境变化或实验操作失误导致的细胞损失。最佳的冻存时机是当细胞处于最佳生长速率时。

冷冻保护剂是细胞冻存过程中的关键成分。常用的冷冻保护剂包括二甲基亚砜（DMSO）和甘油。这些保护剂的主要功能是降低溶液的冰点，减少冰晶的形成，从而有效保护细胞免受冰晶造成的机械损伤。尽管DMSO适合大多数细胞类型，但对于某些细胞，可能需使用甘油作为替代品。

第一阶段：冷冻保存实验步骤

1. 在冷冻管上标记日期、研究人员姓名、细胞编号、传代数和细胞类型（包括任何其他有用信息，如基因改造）。

2. 对于贴壁细胞，先去除细胞培养基，使用PBS清洗，加入适量的胰蛋白酶覆盖细胞，并在37°C恒温培养箱中孵育约2分钟（时间应结合细胞类型调整）。随后，加入等量的培养基以终止消化，轻轻吹打细胞将其冲洗下来，并转移至50mL Falcon管中。

3. 对于悬浮培养细胞，直接将所需体积的细胞转移到50mL Falcon管中。

4. 使用血细胞计数器计算细胞以确定其活力水平，冷冻保存的细胞活力应至少为75%。

5. 在室温下以300× g离心5分钟。

6. 准备冷冻培养基（见表1）。

表1：不同哺乳动物细胞系适用的冻存培养基配方

细胞类型 | 冻存培养基配方

在含有FBS的培养基中培养的细胞 | 90%胎牛血清 + 10%二甲基亚砜

在无血清培养基中培养的细胞 | 90%条件培养基 + 10%二甲基亚砜

需要甘油冷冻的细胞 | 90%胎牛血清 + 10%甘油

混合均匀并加热至37°C后使用。

冷冻培养基中包含必要的冷冻保护剂，如DMSO，以防止形成可能损害细胞膜的冰晶。需注意，DMSO并不适合所有细胞类型，在某些情况下可使用甘油替代。

7. 去除上清液。

8. 加入冻存培养基至所需细胞密度。哺乳动物细胞的浓度通常调整为1×10⁶/mL。在室温下，细胞在冻存液中的停留时间不应超过10分钟。

9. 将1mL样品分装到冷冻管中，盖紧盖子。

10. 将冷冻管转移至室温的冷冻盒，再放入-80°C的冰箱。冷冻盒外侧加入适量异丙醇，以保证温度以每分钟1°C的速度稳定下降。由于冻存前会有较多水分流失，缓慢的冷冻过程（每分钟-1°C）有助于减少细胞内冰晶的形成。

11. 约24小时后，将冷冻管从冷冻盒中取出并转移至液氮中长期储存。通常情况下，冷冻细胞可以在液氮中保存数年。理想状态下，冷冻细胞不应在-80°C下保存超过一周，且应尽快转移至液氮中，长期在-80°C下储存可能会损害细胞活力。

第二阶段：解冻冷冻细胞系实验步骤

1. 从液氮储存器中取出冷冻管，迅速放入37°C水浴中，直至约80%解冻（避免在室温下解冻），该过程不应超过1分钟。

由于缓慢解冻可能对细胞造成损害，通常应尽快进行解冻。同时，DMSO作为冷冻保护剂虽然具有效果，但也有一定的细胞毒性，因此细胞应以快于室温的速度解冻，以便迅速稀释和去除DMSO。快速解冻还可防止冷冻过程中形成的晶体损坏细胞膜。

2. 使用移液器将冷冻管中的物质转移至含约10mL预热培养基的15mL Falcon管中。

3. 以300× g离心5分钟，弃去上清液，并使用适量培养基重悬细胞沉淀。

4. 将细胞悬液转移到培养容器中，然后转移至37°C培养箱进行培养。

在细胞冻存和解冻过程中，采用XPJ的优质冷冻保护剂和培养基，可以显著提高细胞的活性和功能，确保后续实验的成功与可重复性。