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NEWSXPJ慢病毒操作全攻略,生物医疗必看!
来源:鲍秀亨 日期:2025-02-26在之前发布的“叮咚!收下这份慢病毒包装的全攻略”和“慢病毒稳转细胞株的构建”两篇文章中,我们了解到慢病毒能够将外源基因有效整合到宿主染色体上,从而实现长时间的体内表达。其次,慢病毒还具备感染几乎所有哺乳动物细胞、干细胞及原代细胞的能力。由于这些显著的优点,慢病毒成为了强大而高效的基因传递工具,并被广泛应用于生物医学领域。当我们掌握了慢病毒的包装过程,并获得包装好的慢病毒后,接下来的操作该如何进行呢?今天,XPJ将为大家分享从获取慢病毒到后续操作的具体步骤,内容丰富,赶紧继续阅读吧!
包装好的慢病毒建议分装后存放在-80℃冰箱中,储存期限最长可达半年。若使用时间超过半年,建议在使用前重新测定滴度。如果实验在短时间内(3-5天)进行,也可以将病毒存放在4℃下。同时,在使用过程中应尽量避免反复冻融,因为反复冻融会降低病毒滴度,可根据每次实验的用量进行分装。
如需稀释病毒,首先将病毒在冰浴中解冻,然后用PBS或不含血清的培养基稀释均匀后置于4℃保存。为确保病毒滴度,建议在3天内使用完毕。
不同细胞对慢病毒的敏感性存在差异,同时每种慢病毒载体的荧光强度也有不同。因此,在正式实验前,通过预实验确定慢病毒对细胞的感染复数(MOI)及最佳感染条件是至关重要的。这包括接种的细胞量、感染时的总体积及感染后的换液时间,以确保实验效果达到理想状态。同时,根据MOI及细胞数量计算后续实验所需的病毒量。
预实验步骤如下:
在确认慢病毒对靶细胞的亲嗜性及合适的MOI值后,可以开展正式感染实验。在24孔板中使用带有GFP荧光标记及Puromycin抗性的慢病毒感染细胞的具体步骤如下:
使用带有不同抗性的慢病毒成功感染细胞后,感染的细胞能够在含有一定浓度对应抗生素的培养基中存活,而未感染的细胞则无法存活。在抗性筛选压力下,可有效筛选出稳定表达目的基因的细胞株。
例如,带有Puromycin抗性的慢病毒感染后48-72小时(70-80%汇合度),将细胞继续培养于含适当浓度Puromycin的培养基中,每3-4天更换一次含抗生素的培养液,直至未感染病毒的对照组细胞被抗生素杀死,而感染病毒组细胞无死亡(如病毒载体带有荧光标记,荧光效率需达到100%)后,再进行多克隆及单克隆稳转株的筛选。
在筛选过程中,选择细胞的抗生素浓度应为预实验中确定的最低全致死浓度,并设定未感染病毒的野生型细胞作为对照,使用等量浓度的抗生素进行筛选。XPJ相信,通过这些细致的操作步骤,您能够成功构建稳定的细胞株,并在生物医学研究中取得优异的成果。
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