在之前发布的“叮咚！收下这份慢病毒包装的全攻略”和“慢病毒稳转细胞株的构建”两篇文章中，我们了解到慢病毒能够将外源基因有效整合到宿主染色体上，从而实现长时间的体内表达。其次，慢病毒还具备感染几乎所有哺乳动物细胞、干细胞及原代细胞的能力。由于这些显著的优点，慢病毒成为了强大而高效的基因传递工具，并被广泛应用于生物医学领域。当我们掌握了慢病毒的包装过程，并获得包装好的慢病毒后，接下来的操作该如何进行呢？今天，XPJ将为大家分享从获取慢病毒到后续操作的具体步骤，内容丰富，赶紧继续阅读吧！

1. 病毒的储存

包装好的慢病毒建议分装后存放在-80℃冰箱中，储存期限最长可达半年。若使用时间超过半年，建议在使用前重新测定滴度。如果实验在短时间内（3-5天）进行，也可以将病毒存放在4℃下。同时，在使用过程中应尽量避免反复冻融，因为反复冻融会降低病毒滴度，可根据每次实验的用量进行分装。

2. 病毒的稀释

如需稀释病毒，首先将病毒在冰浴中解冻，然后用PBS或不含血清的培养基稀释均匀后置于4℃保存。为确保病毒滴度，建议在3天内使用完毕。

3. 预实验摸索最佳MOI

不同细胞对慢病毒的敏感性存在差异，同时每种慢病毒载体的荧光强度也有不同。因此，在正式实验前，通过预实验确定慢病毒对细胞的感染复数（MOI）及最佳感染条件是至关重要的。这包括接种的细胞量、感染时的总体积及感染后的换液时间，以确保实验效果达到理想状态。同时，根据MOI及细胞数量计算后续实验所需的病毒量。

预实验步骤如下：

1. 第1天，将生长状态良好的目标细胞以1×10⁴个/孔接种于96孔板中，放入37℃，5% CO₂培养箱中培养过夜。接种细胞数量可根据细胞生长速度略有调整，一般于第2天使细胞密度达到30-50%。
2. 第2天，根据文献中的MOI值设置梯度范围，一般为3-100。取出-80℃冰箱中的病毒，解冻后假设病毒滴度为1×10⁸ TU/mL，按MOI为5，10，30，50，100计算每孔需加入病毒原液分别为0.5μL，1μL，3μL，5μL，10μL。根据每孔需加入的病毒量及重复孔数配置病毒稀释液，确保每孔总体系为100µL。可以同时设计含有Polybrene的培养基实验组及空细胞组（Blank组）。
3. 第3天，更换培养液。一般在病毒感染16-24小时后，将含有慢病毒的培养液更换为正常培养液，继续培养。
4. 第4-5天，检测感染效率，使用倒置荧光显微镜观察感染48小时至72小时后的荧光并拍照，以此对比细胞明场及荧光，估算慢病毒感染效率，最终确定合适的MOI值以进行正式实验。

4. 从感染到目标细胞稳转株的构建

在确认慢病毒对靶细胞的亲嗜性及合适的MOI值后，可以开展正式感染实验。在24孔板中使用带有GFP荧光标记及Puromycin抗性的慢病毒感染细胞的具体步骤如下：

1. 第一天，根据实验要求将目标细胞按5-10×10⁴cells/孔的密度铺板，细胞数应保证第二天密度约为50%，在37℃下培养过夜。
2. 第二天，感染前从-80℃冰箱中取出病毒并解冻。根据预实验获得的MOI值，用新鲜完全培养基将病毒稀释至所需浓度，注意轻轻混匀，不可用振荡器。
3. 吸去细胞原有培养基，将稀释后的病毒液加入细胞中，并根据预实验结果决定是否需要添加Polybrene。如果对细胞无影响，Polybrene可以与病毒原液共同加入培养基中，轻轻摇匀后在37℃培养过夜。
4. 感染16-24小时后，吸除含慢病毒的培养基，并更换为新鲜培养基。具体感染时间可参考预实验中慢病毒对细胞状态的影响。
5. 继续培养至感染48-72小时后，根据需要收集细胞以检测目的蛋白的表达。

5. 目的细胞的稳定转株构建

使用带有不同抗性的慢病毒成功感染细胞后，感染的细胞能够在含有一定浓度对应抗生素的培养基中存活，而未感染的细胞则无法存活。在抗性筛选压力下，可有效筛选出稳定表达目的基因的细胞株。

例如，带有Puromycin抗性的慢病毒感染后48-72小时（70-80%汇合度），将细胞继续培养于含适当浓度Puromycin的培养基中，每3-4天更换一次含抗生素的培养液，直至未感染病毒的对照组细胞被抗生素杀死，而感染病毒组细胞无死亡（如病毒载体带有荧光标记，荧光效率需达到100%）后，再进行多克隆及单克隆稳转株的筛选。

在筛选过程中，选择细胞的抗生素浓度应为预实验中确定的最低全致死浓度，并设定未感染病毒的野生型细胞作为对照，使用等量浓度的抗生素进行筛选。XPJ相信，通过这些细致的操作步骤，您能够成功构建稳定的细胞株，并在生物医学研究中取得优异的成果。