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XPJ慢病毒操作全攻略,生物医疗必看!

来源:鲍秀亨 日期:2025-02-26

在之前发布的“叮咚!收下这份慢病毒包装的全攻略”和“慢病毒稳转细胞株的构建”两篇文章中,我们了解到慢病毒能够将外源基因有效整合到宿主染色体上,从而实现长时间的体内表达。其次,慢病毒还具备感染几乎所有哺乳动物细胞、干细胞及原代细胞的能力。由于这些显著的优点,慢病毒成为了强大而高效的基因传递工具,并被广泛应用于生物医学领域。当我们掌握了慢病毒的包装过程,并获得包装好的慢病毒后,接下来的操作该如何进行呢?今天,XPJ将为大家分享从获取慢病毒到后续操作的具体步骤,内容丰富,赶紧继续阅读吧!

XPJ慢病毒操作全攻略,生物医疗必看!

1. 病毒的储存

包装好的慢病毒建议分装后存放在-80℃冰箱中,储存期限最长可达半年。若使用时间超过半年,建议在使用前重新测定滴度。如果实验在短时间内(3-5天)进行,也可以将病毒存放在4℃下。同时,在使用过程中应尽量避免反复冻融,因为反复冻融会降低病毒滴度,可根据每次实验的用量进行分装。

2. 病毒的稀释

如需稀释病毒,首先将病毒在冰浴中解冻,然后用PBS或不含血清的培养基稀释均匀后置于4℃保存。为确保病毒滴度,建议在3天内使用完毕。

3. 预实验摸索最佳MOI

不同细胞对慢病毒的敏感性存在差异,同时每种慢病毒载体的荧光强度也有不同。因此,在正式实验前,通过预实验确定慢病毒对细胞的感染复数(MOI)及最佳感染条件是至关重要的。这包括接种的细胞量、感染时的总体积及感染后的换液时间,以确保实验效果达到理想状态。同时,根据MOI及细胞数量计算后续实验所需的病毒量。

预实验步骤如下:

  1. 第1天,将生长状态良好的目标细胞以1×104个/孔接种于96孔板中,放入37℃,5% CO2培养箱中培养过夜。接种细胞数量可根据细胞生长速度略有调整,一般于第2天使细胞密度达到30-50%。
  2. 第2天,根据文献中的MOI值设置梯度范围,一般为3-100。取出-80℃冰箱中的病毒,解冻后假设病毒滴度为1×108 TU/mL,按MOI为5,10,30,50,100计算每孔需加入病毒原液分别为0.5μL,1μL,3μL,5μL,10μL。根据每孔需加入的病毒量及重复孔数配置病毒稀释液,确保每孔总体系为100µL。可以同时设计含有Polybrene的培养基实验组及空细胞组(Blank组)。
  3. 第3天,更换培养液。一般在病毒感染16-24小时后,将含有慢病毒的培养液更换为正常培养液,继续培养。
  4. 第4-5天,检测感染效率,使用倒置荧光显微镜观察感染48小时至72小时后的荧光并拍照,以此对比细胞明场及荧光,估算慢病毒感染效率,最终确定合适的MOI值以进行正式实验。

4. 从感染到目标细胞稳转株的构建

在确认慢病毒对靶细胞的亲嗜性及合适的MOI值后,可以开展正式感染实验。在24孔板中使用带有GFP荧光标记及Puromycin抗性的慢病毒感染细胞的具体步骤如下:

  1. 第一天,根据实验要求将目标细胞按5-10×104cells/孔的密度铺板,细胞数应保证第二天密度约为50%,在37℃下培养过夜。
  2. 第二天,感染前从-80℃冰箱中取出病毒并解冻。根据预实验获得的MOI值,用新鲜完全培养基将病毒稀释至所需浓度,注意轻轻混匀,不可用振荡器。
  3. 吸去细胞原有培养基,将稀释后的病毒液加入细胞中,并根据预实验结果决定是否需要添加Polybrene。如果对细胞无影响,Polybrene可以与病毒原液共同加入培养基中,轻轻摇匀后在37℃培养过夜。
  4. 感染16-24小时后,吸除含慢病毒的培养基,并更换为新鲜培养基。具体感染时间可参考预实验中慢病毒对细胞状态的影响。
  5. 继续培养至感染48-72小时后,根据需要收集细胞以检测目的蛋白的表达。

5. 目的细胞的稳定转株构建

使用带有不同抗性的慢病毒成功感染细胞后,感染的细胞能够在含有一定浓度对应抗生素的培养基中存活,而未感染的细胞则无法存活。在抗性筛选压力下,可有效筛选出稳定表达目的基因的细胞株。

例如,带有Puromycin抗性的慢病毒感染后48-72小时(70-80%汇合度),将细胞继续培养于含适当浓度Puromycin的培养基中,每3-4天更换一次含抗生素的培养液,直至未感染病毒的对照组细胞被抗生素杀死,而感染病毒组细胞无死亡(如病毒载体带有荧光标记,荧光效率需达到100%)后,再进行多克隆及单克隆稳转株的筛选。

在筛选过程中,选择细胞的抗生素浓度应为预实验中确定的最低全致死浓度,并设定未感染病毒的野生型细胞作为对照,使用等量浓度的抗生素进行筛选。XPJ相信,通过这些细致的操作步骤,您能够成功构建稳定的细胞株,并在生物医学研究中取得优异的成果。

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