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NEWSXPJ双荧光素酶报告基因实验原理
来源:甄若振 日期:2025-02-27双荧光素酶报告基因实验的原理是利用双荧光素酶作为标记,以研究生物医疗领域中的基因表达与调控机制。该实验是一种基因表达定量分析技术,通过将双荧光素酶(Luciferase)作为报告基因插入靶基因启动子或转录后区域,从而与靶基因进行协同表达。当荧光素基质(Luciferin)被添加时,双荧光素酶催化荧光素基质的氧化反应,产生可检测的光信号,进而定量测定报告基因的活性水平。
首先,需要将双荧光素酶编码序列克隆入适当的表达载体中,并将其导入目标细胞,使其与靶基因的表达协同进行。接下来,添加荧光素基质,通过检测产生的光信号来定量测定报告基因的表达水平。该技术具有高度的灵敏度和精准度,操作简便且结果重复性好,因此在生物医疗研究中具有重要应用,包括基因表达调控机制研究、药物筛选及细胞信号通路检测等。
XPJ的双荧光素酶报告基因实验通常使用两种不同的荧光素酶报告基因:萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase,作为实验报告基因)和海肾荧光素酶(Renilla Luciferase,作为内参报告基因)。这两种荧光素酶具有不同的发光底物和光谱,可以在同一实验中独立测量其活性。
1. **构建报告基因载体**:将兴趣启动子或调控元件克隆到萤火虫荧光素酶基因(luc)的上游,从而构建实验报告基因载体。海肾荧光素酶基因(hRluc)则构建在一个与恒定表达启动子(如SV40)相连的载体中,作为内参报告基因。
2. **细胞转染**:将上述两个载体共同转染入细胞中。实验报告基因的表达水平会受到启动子或调控元件的影响,而内参报告基因的表达水平相对恒定,有助于校正转染效率及细胞活性。
3. **细胞培养**:在特定条件下培养转染细胞,使其能有效表达荧光素酶基因。
4. **裂解细胞**:收集并裂解细胞以释放荧光素酶。
5. **测定荧光素酶活性**:首先,加入萤火虫荧光素酶的底物(如荧光素),测定其发光强度。随后,加入海肾荧光素酶的底物(如Coelenterazine),再测定其发光强度。这两种荧光素酶的活性可通过底物的发光强度分别测定。
6. **数据分析**:计算萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性的比值(通常为萤火虫荧光素酶活性除以海肾荧光素酶活性),以校正转染效率和细胞数目差异,从而获得更为准确的实验结果。
XPJ的双荧光素酶报告基因实验具有以下优势:
XPJ双荧光素酶报告基因实验的应用包括:
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