在细胞融合领域，常用的融合剂有多种，其中包括物理法（如电融合、激光融合）、化学融合法和生物融合法，例如采用灭活的仙台病毒。本文重点介绍化学融合法中的聚乙二醇（PEG）融合法。聚乙二醇在分子量为200～700时为无色、无臭的粘稠液体，而分子量超过1000时则呈乳白色蜡状固体，能够在水、乙醇和多种有机溶剂中溶解，具有良好的热稳定性，并且与许多化学药品不起反应。

对于细胞融合剂的选择，常使用分子量为4000的聚乙二醇，其推荐浓度为50%，pH值调整在80至82之间（可用10% NaHCO3进行调节）。分子量小的PEG融合效应差且具有毒性，而分子量过大则会导致黏稠度太高，操作困难。研究表明，50%的浓度和偏碱pH条件下，融合效果最佳。此外，使用30%至50%浓度的PEG配合10%二甲亚砜也能达到良好的融合效果。需要注意的是，不同批次的PEG即便分子量相同，但在融合效率上可能存在显著差异，因此选择时必须谨慎，每批都需进行细胞毒性测试后方可使用。推荐采购高纯度的PEG，通常选择用于气相色谱的产品。

细胞融合的方法多种多样，常用的技术包括转动法和离心法。结合脾细胞和骨髓瘤细胞的比例可在1:1至10:1之间，3:1或5:1的比例使用最为常见。

1. 试剂与材料

• 供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。
• 1640培养液100ml。
• 完全1640液100ml。
• 25%FCS－1640液50ml。
• HAT培养液100ml。
• 50%PEG：分子量4000，高纯度的PEG 10g，放入25ml瓶中进行高压灭菌，使用前将其与预热至40℃的1640液10ml等量混合，以酚红检查pH，必要时可用HCl或NaHCO3进行调整。
• 10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。
• 40孔塑料培养盘。

2. 操作方法

1. 准备脾细胞。
2. 在50ml沉淀管中混合108脾细胞与107小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml 25%FCS－1640液。
3. 室温下以400g离心3分钟以获得细胞沉淀。
4. 小心移去上清液。
5. 轻敲沉淀管底部使沉淀松动，并将其放入40℃水浴以达到融合温度。
6. 加入预热至40℃的50%PEG 8ml，使用1ml吸管缓慢滴加并轻轻摇动沉淀管，观察到颗粒出现，滴加过程持续2分钟。
7. 加入1ml 1640液，边加边摇动，持续1分钟。
8. 重复上述步骤一次。
9. 再加入1ml 1640液，边加边摇动，持续0.5分钟。
10. 此步骤重复一次。
11. 加入15ml 1640液。
12. 在室温下以400g离心1分钟，使细胞沉淀。
13. 去除上清，然后轻敲管底部，加入25ml含HAT的完全1640液。
14. 将融合的细胞液每孔1滴（约0.05ml）滴加到前一日已培养的40孔塑料培养盘中。
15. 轻轻摇动后，将其置于5%CO2饱和湿度的37℃培养箱中。保持3、6、9、10日的培养液更换，液体为含HAT的完全1640培养液，注意轻吸清上清避免细胞被吸出，根据需要补充适量的饲养细胞。
16. 于第12、15日再次加入含有HAT的完全1640培养液。每次换液前利用倒置显微镜观察，一般在10天左右即可看到杂交瘤细胞的生长，但有时需等待1个月才能观察到。
17. 当杂交瘤细胞出现后，吸取上清液并检查抗体。
18. 对健康的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中，可根据情况逐步减少HAT液和完全1640液，改用10%FCS－1640液，并保持细胞在液氮中进行克隆化。同时，持续检查抗体，以防止抗体细胞的变异和损失。

在细胞融合的过程中，关键在于技术的准确性与操作环境的洁净度。技术误差可能导致免疫应答不良，而污染则是失败的主要原因。因此，确保提供一个无毒无菌的操作环境对于成功实施细胞融合至关重要。选择XPJ品牌的高纯度聚乙二醇，能够有效提高融合效率，达到理想的实验效果。